اندازه گیری بخش های نیتروژن بر اساس مدل (CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System
اندازه گیری بخش های نیتروژن بر اساس مدل (CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System

اندازه گیری بخش های نیتروژن اساس مدل CNCPS
Cornell Net Carbohydrate and Protein System

روش های شیمیایی مورداستفاده به منظور تعیین بخش های نیتروژن دار نمونه های آزمایشی بر اساس پیشنهادات لیسترا و همکاران به کار گرفته میشود. این روش ها عبارت اند از:

 نیتروژن غیر پروتئینی (NPN)

میزان ۵/۰ گرم نمونه در یک ظرف شیشه ای (۲۰۰ میلی لیتر) توزین می شود. پس از آن ۵۰ میلی لیتر آب مقطر دو بار تقطیر شده و سرد شده به آن اضافه می گردد. سپس حدود ۸ میلی لیتر محلول ۳/۰ مولار تنگستات سدیم (۱۰۰ گرم پودر تنگستات سادیم به حجم یک لیتر) بر روی نمونه ریخته شده و برای مدت نیم ساعت در حرارت معمولی اتاق رها می گردد. با استفاده از محلول ۵/۰ مولار (یک نرمال) اسید سولفوریک (۱۷/۲۷میلی لیتر اسید سولفوریک به حجم یک لیتر) میزان pH محلول به ۲ رسانیده می شود و سپس به مدت حداقل ۲۴ ساعت (overnight) در دمای معمولی محیط گذاشته می شود. محلول به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی صاف می گردد و سپس میزان نیتروژن در رسوب باقی مانده با استفاده از روش کجلدال تعیین می شود. میزان NPN از طریق تفاضل نیتروژن رسوب از کل نیتروژن نمونه آزمایشی به دست می آید.

دستگاه کجلدال ( کلدال )

پروتئین محلول در حلال بافری (BSP)

حدود ۵۰ میلی لیتر باقر بورات – فسفات (محتوى ۲/۱۲ گرم منوسدیم فسفات، ۸۹۱ گرم تترابورات سدیم و ۱۰۰ میلی لیتر الکل ترشیاری بوتیل در یک لیتر آب مقطر دو بار تقطیر) به ۵/۰ گرم نمونه در یک ظرف شیشه ای ۴۰۰ میلی لیتری اضافه می شود. پس از اضافه نمودن یک میلی لیتر سدیم آزید  ۱۰% (۱۰ گرم به حجم ۱۰۰ میلی لیتر) (محلول تازه باشد)، محلول حاصل به مدت ۳ ساعت بر روی دستگاه تکان دهنده در دمای معمولی آزمایشگاه تکان داده می شود. سپس با استفاده از کاغذ صافی محلول موردنظر صاف می گردد و رسوب روی کاغذ صافی با آب مقطر دوبار تقطیر سرد شستشو داده می شود. میزان نیتروژن رسوب با استفاده از روش کجلدال تعیین می گردد. میزان کل پروتئین خام محلول از طریق تفاضل نیتروژن رسوب از کل نیتروژن نمونه آزمایشی و حاصل ضرب آن در عدد ۲۵/۶ محاسبه می شود. اما میزان پروتئین حقیقی محلول از طریق تفاضل نیتروژن رسوب از نیتروژن غیر محلول در روش تعیین NPN محاسبه می شود.

بیشتر بدانید : اسید آمینه در تغذیه

نیتروژن غیر محلول در شوینده خنثی (NDIN)

میزان۵ /۰ گرم از نمونه را داخل کیسه های داکرون می ریزیم و آنها را داخل محلول )NDS به ازای هر کیسه ۶۰ میلی لیتر) می اندازیم و سپس در اتوکلاو در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۷۵ دقیقه قرار می دهیم. سپس کیسه ها را شستشو می دهیم و باقیمانده را برای اندازه گیری پروتئین استفاده می کنیم.

 نیتروژن غیر محلول در شوینده اسیدی (ADIN)

میزان ۵/۰ گرم از نمونه را داخل کیسه های داکرون می ریزیم آن ها راداخل محلول ADS (به ازای هر کیسه ۶۰ میلی لیتر) می اندازیم و سپس در اتوکلاو در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۷۵ دقیقه قرار می دهیم. سپس کیسه ها را شستشو می دهیم و باقیمانده را برای اندازه گیری پروتئین استفاده می کنیم.

تعیین تجزیه پذیری شکمبه ای و روده ای نمونه های آزمایشی با روش سه مرحله ای – آنزیمی (۳- Step)

روش سه مرحله ای- آنزیمی به کار رفته در این آزمایش مطابق روش پیشنهادی کالز امیگلیا و استرن (۱۹۹۵) هست.

در مرحله اول میزان مشخصی از نمونه ها در داخل کیسه های داکرونی ریخته می شود و به مدت ۱۲ ساعت در درون شکمبه قرار داده می شود و سپس نیتروژن موجود در ماده خشک باقیمانده در کیسه ها تعیین می گردد.

در مرحله بعدی میزان مشخصی از ماده خشک باقیمانده از مرحله قبل که حاوی ۱۵ میلی گرم نیتروژن بود در داخل تیوب های ۵۰ میلی لیتری ریخته می شود. ۱۰ میلی لیتر محلول پپسین HCL  (۲۸/۸ میلی لیتر HCL به حجم یک لیتر و حاوی یک گرم پیسین در هر لیتر) به هر تیوب اضافه می شود و به مدت یک ساعت در حمام بن ماری (دمای ۳۸ درجه) قرار داده می شود.

بیشتر بدانید : اﺻﻮل ﺗﻮازن آمینواسیدها در ﺟﯿﺮه گاوﻫﺎی ﺷﯿﺮی

در ادامه میزان ۵/۰ میلی لیتر سود یک نرمال و ۵/۱۳ میلی لیتر بافر پنکراتین – فسفات (۶۸ گرم KH2PO4 را به حجم یک لیتر می رسانیم و حاوی ۳ گرم پانکراتین، pH  محلول را با استفاده از محلول NaOH غلیظ مرک به ۸/ ۷ می رسانیم) به تیوب ها افزوده می شود و انکوباسیون به مدت ۲۴ ساعت ادامه می یابد. پس از طی این زمان ۳ میلی لیتر اسید تری کلرواستیک (TCA) ۱۰۰%  وزنی حجمی (۱۰۰ گرم TCA به حجم ۱۰۰ میلی لیتر) به هر تیوب اضافه پس از ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰۰g به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ می گردد. در انتها به منظور قابلیت هضم روده ای میزان نیتروژن موجود در سوپر ناتانت هر تیوب اندازه گیری می شود ۵ میلی لیتر از سوپر ناتانت برای اندازه گیری میزان پروتئین نمونه برداری می شود.

اندازه گیری بخش های نیتروژن بر اساس مدل (CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System

اشتراک گذاری

امتیاز شما به این مطلب

منبع: فصلنامه علمی تخصصی رویان

برای کپی کلیک کنید

دیدگاهتان را بنویسید